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新聞資訊

NEWS AND INFORMATION

2025年撫生生物春節(jié)放假通知
發(fā)布時間:2025-01-24
細胞傳代培養(yǎng)實驗步驟事項

實驗原理:
將動物機體的各種組織從機體中取出,經各種酶(常用胰蛋白酶)、螯合劑(常用EDTA)或機械方法處理,分散成單細胞,置合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),使細胞得以生存、生長和繁殖,這一過程稱原代培養(yǎng)。
細胞在培養(yǎng)瓶長成致密單層后,已基本上飽和,為使細胞能繼續(xù)生長,同時也將細胞數(shù)量擴大,就必須進行傳代(再培養(yǎng))。傳代培養(yǎng)也是一種將細胞種保存下去的方法。同時也是利用培養(yǎng)細胞進行各種實驗的必經過程。懸浮型細胞直接分瓶就可以,而貼壁細胞需經消化后才能分瓶。

實驗儀器:
培養(yǎng)箱(調整至37℃)、培養(yǎng)瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、紗布、手術器械、血球計數(shù)板、離心機、水浴箱(37℃)。

實驗試劑:
1640培養(yǎng)基或DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、0.25%胰酶、Hank′s液、碘酒、75%酒精

實驗步驟:
一、原代細胞培養(yǎng)步驟
1、準備:取各種已消毒的培養(yǎng)用品置于凈化臺面,紫外線消毒20分鐘。開始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。
2、布局:點燃酒精燈,安裝吸管帽。
3、處理組織:把組織塊置于燒杯中,用Hanks液漂洗2-3次,去除血污;如懷疑組織可能污染,可先置于含有青鏈霉素的混合液中30-60分鐘。
4、剪切:用眼科剪把組織切成2-3毫米大小的塊,以便于消化。加入比組織塊總量多30-50倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角燒瓶中,結扎瓶口或塞以膠塞。
5、消化:或用恒溫水浴,或置于37℃溫箱消化均可,消化中每隔20分鐘應搖動一次,如用電磁恒溫攪拌器消化更好。消化時間依組織塊的大小和組織的硬度而定。
6、分離:在消化過程中見消化液發(fā)混濁時,可用吸管吸出少許消化液在鏡下觀察,如組織已分散成細胞團或單個細胞,立即終止消化,隨即通過適宜不銹鋼篩,濾掉尚未充分消化開的組織塊。低速(500-1000轉/分)離心消化液5分鐘,吸出上清,加入適量含有血清的培養(yǎng)液。
7、計數(shù):用計數(shù)板計數(shù),如細胞懸液細胞密度過大,再補加培養(yǎng)液調整后,分裝入培養(yǎng)瓶中。對大多數(shù)細胞來說,pH要求在7.2-7.4范圍,培養(yǎng)液呈微紅色,如顏色偏黃,說明液體變酸,可用NaHCO3調整。
8、培養(yǎng):置于37℃溫箱培養(yǎng),如用CO2溫箱培養(yǎng),瓶口需用紗布棉塞或螺旋帽堵塞,紗布塞易生霉菌,每次換液時需要換新塞。

二、原代組織塊培養(yǎng)法
1、剪切:把組織小塊置于小燒杯或青霉素小瓶中,用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污,吸靜Hanks液,用眼科剪反復剪切1mm塊為止。
2、擺布:用彎頭吸管吸取若干小塊,置于培養(yǎng)瓶中,用吸管彎頭把組織小塊擺布在培養(yǎng)瓶底部,小塊相互距離以0.5cm為宜,每一25ml培養(yǎng)瓶底可擺布20-30塊。
3、輕輕翻轉培養(yǎng)瓶,另瓶底向上,注意翻瓶時勿另組織小塊流動,塞好瓶塞,置37℃溫箱培養(yǎng)2小時左右(勿超過4小時),使小塊微干涸。
4、培養(yǎng):從微箱中取出培養(yǎng)瓶,開塞,46度斜持培養(yǎng)瓶,箱瓶底腳部輕輕注入培養(yǎng)液少許,然后緩緩再把培養(yǎng)瓶翻轉過來,讓培養(yǎng)液慢慢覆蓋附于瓶地上的組織小塊。置溫箱中靜止培養(yǎng)。待細胞從組織塊游出數(shù)量增多后。再補加培養(yǎng)液。

三、貼壁細胞傳代的操作步驟:
1、吸除培養(yǎng)瓶內舊培養(yǎng)液。
2、向瓶內加入胰蛋白酶和EDTA混合液少許,以能覆滿瓶底為限。
3、置溫箱中2-5分鐘,當發(fā)現(xiàn)細胞質回縮,細胞間隙增大后,立即終止消化。
4、吸除消化液,向瓶內注入Hanks液數(shù)毫升,輕輕轉動培養(yǎng)瓶,把殘余消化液沖掉。注意加Hanks液沖洗細胞時,動作要輕,以免把已松動的細胞沖掉流失,如用胰蛋白酶液單獨消化,吸除胰蛋白酶液后,可不用Hanks液沖洗,直接加入培養(yǎng)液。
5、用吸管吸取營養(yǎng)液輕輕反復吹打瓶壁細胞,使之從瓶壁脫離形成細胞懸液。
6、計數(shù)板計數(shù)后,把細胞懸液分成等份分裝入數(shù)個培養(yǎng)瓶中,置溫箱中培養(yǎng)。

四、懸浮型細胞傳代
1、吸出細胞培養(yǎng)液,放入離心管中,離心1000rpm5分鐘。
2、吸掉上清液,加入適量之新鮮培養(yǎng)基,混和均勻后,依稀釋比例轉移至新的培養(yǎng)瓶中,以正常培養(yǎng)條件培養(yǎng)。

注意事項:
1、操作前要洗手,進入超凈臺后手要用75%酒精或0.2%新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。
2、點燃酒精燈,操作在火焰附近進行,耐熱物品要經常在火焰上燒灼,金屬器械燒灼時間不能太長,以免退火,并冷卻后才能夾取組織,吸取過營養(yǎng)液的用具不能再燒灼,以免燒焦形成碳膜。
3、操作動作要準確敏捷,但又不能太快,以防空氣流動,增加污染機會。
4、不能用手觸已消毒器皿的工作部分,工作臺面上用品要布局合理。
5、瓶子開口后要盡量保持45℃斜位。
6、 吸溶液的吸管等不能混用。

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活動時間:8月3日-8月5日

本活動權限終端客戶

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參考文獻

LITERATURE

BIOPHARMACEUTICS & DRUG DISPOSITION
Aquaculture Reports
Journal of Pharmaceutical Analysis
ENVIRONMENTAL POLLUTION
Nature Biomedical Engineering
ADVANCED FUNCTIONAL MATERIALS
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